印迹杂交

在基因操作过程中，首先将 DNA 或 RNA、蛋白质等在薄膜滤器上进行浸润，接着进行固定，然后在薄膜滤器上进行杂交，从而生成杂种分子。这是基因操作中最为常用的技术。

分析方法

印迹杂交是基因诊断技术的一种，它有多种方式。其中第一种是将 RNA 从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。第二种是印迹杂交。它是通过凝胶（）将经限制性内切酶（）消化后的 DNA（）片段进行电离。第三种是印迹杂交。首先将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳，依据分子量大小进行分离。接着把分离后的蛋白转移到杂交膜（blot）上。最后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测。

分析对象

杂交可用于对 RNA 进行分析；杂交也可用于对 DNA 进行分析；杂交还可用于对蛋白质进行分析（ /view/.htm）。其大致过程为：一是对 DNA 进行酶切，接着通过凝胶电泳将各酶切片段分离，之后让 DNA 进行原位变性。(5)通过显影来查看目的 DNA 所处的位置。

方式简介

杂交

用于分析 RNA，比如 http:​\/​​\/​.​\/​view​\/​759.htm 这种 RNA，涵盖正向杂交、反向杂交以及斑点杂交等方式。

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DNA印迹实验方法

正向杂交的做法是把待测 RNA 固定在纤维膜上，接着用特异序列 DNA 探针与它进行杂交，之后进行显影观察。反向杂交的做法是把特异序列 DNA 固定在纤维膜上，然后用待测 RNA 做成探针与它进行杂交，随后进行显影观察。

杂交

主要用于对 DNA 进行分析，同时涵盖正向杂交、反向杂交和斑点杂交。其中，正向杂交是把待测 DNA 固定在纤维膜上，接着用特异序列的 RNA 探针与之杂交，然后进行显影观察。反向杂交则是将特异序列的 RNA 固定在纤维膜上，再用待测 DNA 做成探针与它杂交，之后进行显影观察。

杂交

用于分析蛋白质，依据抗原抗体特异性结合的原理。此方法分为三种：抗原法、夹心法、竞争法。其中抗原法是把待测抗原固定在膜上，接着加入特异抗体让其与之结合，然后洗膜，再进行显色，最后观察。夹心法是把一抗固定在膜上，加入待测抗原，接着洗膜，再加入特异二抗，之后洗膜，再进行显色，最后观察。竞争法分为对照和试验两组。对照组是把特异抗原固定在膜上，实验组则是把待测抗原固定在膜上。然后两组都加入特异抗体，接着进行显色操作并进行观察。其目的是用于比较抗原的特异性。

印迹杂交

印迹杂交是一种将 RNA 从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。1975 年创建了 DNA 印迹技术，称为印迹技术，RNA 印迹技术与 DNA 相对应，所以被称为印迹杂交，原理相似的蛋白质印迹技术则被称作其他名称。印迹杂交由印杂交法演变而来，其被测样品为 RNA。甲醛或聚乙二醛使其变性，然后进行电泳分离，接着将其转移到固相支持物上，在此进行杂交反应，目的是鉴定基因中特定 mRNA 分子的量与大小。该法是常用于研究基因表达的方法。它能够推出癌基因的表达程度。

印迹杂交

印迹杂交（）1975年由英国创建。

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印迹杂交示意图

印迹杂交是对经凝胶电离且经限制性内切酶消化后的 DNA 片段进行操作。先将凝胶上的 DNA 变性，接着在原位把单链 DNA 片段转移到硝基纤维素膜或其他固相支持物上，然后进行干烤固定。之后再与具有相对应结构且已标记的探针进行杂交反应，最后通过放射性自显影或酶反应显色，来检测特定大小分子的含量。可以进行酶切图谱分析，用于克隆基因；可以进行定性及定量分析，针对基因组基因；可以进行基因突变分析；还可以进行限制性长度多态性分析（RELP）等。

印迹杂交

蛋白免疫印迹杂交，它会将蛋白样本利用聚丙烯酰胺电泳，依据分子量大小进行分离。接着把分离后的蛋白样本转移到杂交膜（blot）上。之后通过一抗/二抗复合物来对靶蛋白进行特异性的检测。WB 是在进行蛋白质分析时，最为流行且成熟的技术之一。

方法介绍

综述

印迹杂交的 RNA 吸印和印迹杂交的 DNA 吸印方法相近，只是在进样这方面有所不同。 印迹杂交的 RNA 吸印有其特定的进样方式，印迹杂交的 DNA 吸印也有其相应的进样方式，二者在进样环节存在差异。 印迹杂交的 RNA 吸印的进样与印迹杂交的 DNA 吸印的进样不一样，各自有着独特之处。

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杂交印迹膜

用甲基氢氧化银使 RNA 变性，不用 NaOH ；用乙二醛使 RNA 变性，不用 NaOH ；用甲醛使 RNA 变性，不用 NaOH 。因为 NaOH 会水解 RNA 的 2'-羟基基团。RNA 变性之后，有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜相结合。它也能够在高盐环境中进行转印，然而在烘烤之前，它与膜结合得并不稳固。所以，在转印之后需要用低盐缓冲液进行洗脱，倘若不这样做，RNA 就会被洗脱。在胶中不能添加 EB，因为 EB 会对 RNA 与硝酸纤维素膜的结合产生影响。为了测定片段的大小，能够在同一块胶上添加分子量标记物并一同进行电泳。接着把标记物切下来，给它染上颜色，然后进行照像。而样品胶则要进行转印。标记物胶上色的方法为：在暗室中把它浸在含 5μg/ml EB 的 0.1mol/L 醋酸铵中。光在水中能够脱色。在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的 RNA 胶应尽量少接触紫外光。如果接触过多或在白炽灯下暴露过久，就会使 RNA 信号降低。在琼脂糖凝胶中分离功能完整的 mRNA 时，甲基氢氧化银是一种强力且可逆的变性剂，不过它有毒性。正因如此，许多人更倾向于使用甲醛作为变性剂。同时，所有操作都应避免受到污染，包括 RNA 甲醛凝胶电泳和吸印方法等相关操作。

试剂

甲醛：需用水配制成 37%的浓度（12.3mol/L），操作时应在通风柜中进行，且 pH 要高于 4.0。20 倍的 SSC；去离子的甲酰胺；每升含氢氧化钠且含每升氯化钠；0.1 摩尔每升的 Tris，pH 值为 7.5。

步骤

在 40ml 水中加入 7g 琼脂糖，将其煮沸使其溶解，接着冷却到 60℃，然后加入×MSE 缓冲液，再加入 11.5ml 甲醛，之后加水使总体积定容至 70ml，将其混匀后倒入盛胶槽。待胶凝固之后，把梳子和胶布去掉，把盛胶槽放置到装有 1×MSE 缓冲液的电泳槽中。将最多 20μg 的 RNA 进行变性处理，RNA 体积为 4.5ml，加入 20ml 的 10×MSE 缓冲液、3.5ml 的甲醛以及 10ml 的去离子甲酰胺。接着在 55℃下加热，然后进行冰浴冷却。之后加入 2ml 的 5×载样缓冲液。再进行上样操作，同时加入 RNA 标记物。接着以 60 伏的电压电泳过夜。之后取出凝胶，在水中浸泡两次，每次浸泡 5 分钟。取出硝酸纤维素膜，在 80℃的真空环境下烘烤 2 个小时。

印迹的制备

预备

按照下述步骤进行操作，在每泳道中加入 10 至 20μg 的总 RNA 或者 0.5 至 1μg 的 poly(A)+RNA，接着进行甲醛/琼脂糖凝胶电泳。之后，把凝胶放置在紫外线透照仪上，并且在其旁边放置一个标尺，然后进行拍照。总 RNA（10 至 20μg）在 65℃下进行温育，时间为 5 分钟，所用溶液如下：其中有 6.0μl 的总 RNA（10 至 20μg），还有 12.5μl 的甲酰胺。

该链接为 http:​\/​​\/​.​\/​​\/​7779 。

印迹杂交

10×MOPS 缓冲液为 2.5μl，甲醛溶液（37%）为 4.0μl。b 步骤，将其置于冰浴中迅速冷却，接着加入 2.5μl 上样缓冲液，然后将其加样于按如下配制的甲醛/琼脂糖凝胶中。琼脂糖的用量为 1.0g，10×MOPS 缓冲液的用量为 10.0ml，H2O 的用量为 73.0ml。将这些物质混合后加热至 100℃使其溶解凝胶，接着放置在 50℃的水浴箱中降温。然后加入 17ml 甲醛，将其混匀并立即倒胶。整个操作过程需要在通风橱内佩戴手套进行，并且使用一个专门的电泳槽来进行 RNA 电泳。

印迹

当凝胶处于电泳状态时，裁出一张和凝胶大小一样的滤纸，然后用 20×SSC 对其进行浸泡。接着安装转移装置，在盘内倒入杂交缓冲液（20×SSC）。在缓冲液平面上构建一个平台，把凝胶盘翻转过来，在上面盖上三张经 20×SSC 饱和的滤纸（3MM），平台两端的滤纸要浸入到缓冲液中，用 10ml 的玻璃吸管滚动来排出气泡并将滤纸铺平。4、用数毫升 20×SSC 溶液浸没凝胶。再把滤膜放置在凝胶上，要保证凝胶与滤膜之间没有气泡。最后用软铅笔标记出面对凝胶的滤膜面。进行转移操作，持续 12 至 16 小时，要确保槽内有足够的 20×SSC，大概 3L 左右。把滤膜放置在一块干燥的 3MM 滤纸上，稍微让它晾干一下。将 RNA 固定在滤膜上，接着把尼龙膜的 RNA 面朝下，在紫外透照仪中照射 3 至 5 分钟。此滤膜能够用于杂交或者在 4℃的环境下保存，并且尼龙膜需要用塑料袋进行密封（网址： /view/.htm）。

RNA印迹杂交

用 5×SSPE 把 RNA 滤膜浸湿。将浸湿后的 RNA 滤膜移到塑料袋里，把塑料袋四周封好并剪去一个角。把预杂交液预热到 42℃，通过塑料袋开口处加入 0.1ml/cm²的预热预杂交液，要小心地移动，防止加入气泡，从塑料袋中把所有气泡挤压出去，然后密封塑料袋。将塑料袋放在 42℃的水浴摇床中温育 2 至 4 小时；或者把塑料袋夹在两块玻璃板（ /view/6783.htm）之间，放在 42℃的烤箱中 2 至 4 小时，以此来确保滤膜表面没有气泡。把探针置于 95℃使其变性，然后马上将其置于冰浴中冷却 5 分钟。剪杂交袋的一个角，接着把预杂交液倒进 15 毫升或 50 毫升的试管里，然后加入大概 10 至 20 纳克每毫升（用随机引物标记）的探针，通常 106 每毫升就足够了，之后轻轻搅拌使其混合均匀。用一次性的塑料移液管把杂交液加到装有滤膜的塑料袋中。从塑料袋的开口处把所有气泡都挤压出去，用纸巾把流出的少量杂交液擦掉，小心地封好袋口，防止液体漏出。杂交完成后，打开塑料袋的一个角，把杂交液倒入 15 毫升或者 50 毫升的试管中。

在室温下，用漂洗缓冲液 2（0.25×SSC，0.1%SDS）漂洗两次，每次 5 分钟。用 45℃预热的漂洗缓冲液进行漂洗，漂洗次数为 1 到 3 次，每次漂洗都要进行。在更换缓冲液的过程中，需要用盖革计数器来检测滞留在印迹中心的放射性。充分漂洗完毕后，把杂交膜放置在一张 3MM 滤纸上，让其稍微晾干，接着将潮湿的滤膜封存在塑料袋内或者用塑料薄膜进行包裹。滤膜放射自显影：杂交膜被包裹在塑料袋内，且 RNA 面朝上。接着把杂交膜放在 X 射线暗盒底部，然后将胶片放在杂交膜之上。为了方便操作，能够把增感屏固定在暗盒盖上，之后关闭暗盒，在－70℃的环境下曝光 1 天到 2 周的时间。将暗盒从冰箱内移出时，需要有足够的时间，大概 1 小时左右，让其温度调整至平衡。接着在暗室把胶片从暗盒中取出，然后在自动 X 线底片处理仪上进行冲洗。

从杂交膜上除去探针

3. 利用盖革计数器来检测活性的降低情况。

印迹杂交方法

综述

印迹杂交是一种基本技术，可用于研究 DNA 图谱。它在遗传病诊断、DNA 图谱分析以及 PCR 产物分析等方面都具有重要价值。最后烘干固定，此时即可用于杂交。这样就可以确定众多消化产物中含某一特定序列的 DNA 片段的位置和大小。

琼脂糖凝胶电泳

利用琼脂糖凝胶电泳能够轻易地把 DNA 限制酶消解的片段（范围在 0.3 至 25kb 之间）分离开来。对于分离大分子的 DNA 片段（800 及以上），会使用低浓度的琼脂糖（0.7%）。而分离小分子片段（500 及以上），则会使用高浓度的琼脂糖（1.0%）。至于 300 左右的片段，会使用 1.3%的琼脂糖凝胶。因为分离样品的品质不同，分离速度和分辨率的要求也不同，所以可以选用不同规格的电泳槽。在电泳的时候，要把分子量标记物同时加到旁边的孔中，这样就能便于确定样品 DNA 的分子量了。20 伏保持恒压进行电泳，电泳持续一整晚。电泳结束后，把胶浸泡在含有 0.5μg/ml EB 的 TBE 缓冲液中进行染色。也可以将 EB 直接添加到电泳缓冲液中，或者在灌胶之前加入胶片中。在短波透射灯下进行拍照，要加上橙黄色滤色镜，使用高速一次成像胶片，光圈设定为 f4.5，曝光时间为 20 - 40s。

硝酸纤维素膜吸印

把胶片切割成适宜的大小，并且切掉右上角当作记号。把胶片放置在装有变性缓冲液（其中包含 1.5 摩尔/升的氯化钠和 0.5 摩尔/升的氢氧化钠）的盘中，然后轻轻晃动。接着把胶片换到装有中和缓冲液（包含 1 摩尔/升的 Tris-HCl，pH 值为 8.0，以及 0 摩尔/升的氢氧化钠）的盘中，再轻轻晃动。裁一张硝酸纤维素膜，使其大小与胶相同。裁 2 至 4 张 3mm 滤纸，同样使其大小与胶相同。再裁一些吸印纸（可用卫生纸），也要让其大小与胶相同。需注意，硝酸纤维素膜和吸印纸不能比胶大，不然容易形成旁路。将硝酸纤维素膜先浸到水中，然后放入 10×SSC 缓冲液。在接触胶和硝酸纤维素膜的时候，都需要戴上手套进行操作。平盘上放置一块平板，此平板比胶大，在平板上面铺上一张 3mm 滤纸，这张滤纸起到灯蕊的作用。接着在盘中加入少量 10×SSC 缓冲液，缓冲液的厚度为 2.5cm，但不能没过平板，要让 3mm 滤纸充分饱和。然后将胶倒扣在 3mm 滤纸上。最后把浸湿的硝酸纤维素膜放在胶上，并使两者对齐。铺膜时要从一边慢慢放下，这样能防止产生气泡。要是出现了气泡，就可以用吸管（​http:​\/​​\/​.​\/​view​\/​.htm​)把气泡赶出去。同时，不能让膜与胶下的滤纸直接接触。在膜上要放一张 3mm 滤纸，并且这张滤纸不能与胶接触。接着，在上面加上吸印纸以及大约 500g 的重物。这样的膜就可以进行杂交，或者在室温下密封保存。